預(yù)期應(yīng)用
ELISA 法定量測定人血清、血漿或其它相關(guān)生物液體中ICD含量。
實驗原理
用純化的ICD 抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品、生物
素化的ICD 抗體、HRP 標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物（TMB）顯色。TMB 在過氧化物酶
的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成*終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ICD 呈正
相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（ 值），計算樣品濃度。
試劑盒組成及試劑配制
1、酶標(biāo)板：一塊（96 孔）
2、標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2 瓶，請臨用前15 分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋
好后室溫靜置大約10 分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為50 U/L，然后做系
列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，
6.25 U/L，3.12 U/L，1.56 U/L，0.78 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配
制25 U/L 標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）50 U/L 的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.5ml
樣品稀釋液的Eppendorf 管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、樣品稀釋液：1×20ml。
4、檢測稀釋液A：1×10ml。
5、檢測稀釋液B：1×10ml。
6、檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A 1:100 稀釋（如：10 檢
測溶液A / 990 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總
量配制（100 /孔），實際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。
7、檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B 1:100 稀釋。稀釋方法同檢
測溶液A。
8、底物溶液：1×10ml/瓶。
9、濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25 倍。
10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。
11、覆膜：5 張
12、使用說明書：1 份
自備物品
1、酶標(biāo)儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）
2、微量加液器及吸頭，EP 管
3、蒸餾水或去離子水，濾紙
標(biāo)本的采集及保存
1、血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2 小時或4 過夜后于1000 g 離心20 分鐘，取上清即可
檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2、血漿：可用EDTA 或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30 分鐘內(nèi)于 1000 g 離心15分鐘，取
上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3、其它生物標(biāo)本：請1000 g 離心20 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?20 或-80 保
存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：以上標(biāo)本均應(yīng)密封保存，4 保存應(yīng)小于1 周，-20 不應(yīng)超過1 個月，-80 不應(yīng)超過2
個月；標(biāo)本溶血會影響*后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。
操作步驟
實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解；試劑或樣品配制時，
均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣
品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1、加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100 ，余孔分別加
標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 ，注意不要有氣泡，加樣時將樣品加于酶標(biāo)板底部，盡量不觸
及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37度 溫育2 小時。為保證實驗結(jié)果有效
性，每次實驗請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。
2、棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨用前配制），酶標(biāo)板加
上覆膜，37 溫育1 小時。
3、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3 次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干（也可輕
拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4、每孔加檢測溶液B 工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37 溫育1 小時。
5、棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次，方法同步驟3。
6、每孔加底物溶液90 ，酶標(biāo)板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時間控制在15-30 分鐘，當(dāng)
標(biāo)準(zhǔn)孔的前3-4 孔有明顯的梯度藍色，后3-4 孔梯度不明顯時，即可終止）。
7、每孔加終止溶液50 ，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物
液的加入順序相同。
8、立即用酶標(biāo)儀在450nm 波長測量各孔的光密度（ 值）。
注：
1、試劑準(zhǔn)備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。
實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2、加樣：加樣或加試劑時，個孔與*后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不
同的“預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準(zhǔn)確性及重復(fù)性。一次加樣時間（包括
標(biāo)準(zhǔn)品及所有樣品）控制在10 分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進行實驗。
3、溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標(biāo)板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)；
洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標(biāo)板處于干燥狀態(tài)；同時應(yīng)嚴(yán)格遵守給
定的溫育時間和溫度。
4、洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中
吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響*后的酶標(biāo)儀讀數(shù)。
5、試劑配制：Detection A 及Detection B 在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁
或瓶蓋的液體沉積到管底。標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A 工作液、檢測溶液B 工作液請依據(jù)所需
的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請精確配制標(biāo)準(zhǔn)品及工作液，盡
量不要微量配制（如吸取檢測溶液A 時，一次不要小于10 ），以避免由于不準(zhǔn)確稀釋
而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A 工作液、檢測溶液B 工
作液。
6、反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10 分鐘），如
顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標(biāo)儀光密度讀數(shù)。
7、底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
洗板方法
1、手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml 注入孔內(nèi)，浸泡1-2 分鐘，吸去（不可
觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾
次；根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
2、自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
特異性
本試劑盒可同時檢測重組或天然的人ICD，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
計算
各標(biāo)準(zhǔn)品及樣本值扣除空白孔值后作圖（七點圖），如設(shè)置復(fù)孔，則應(yīng)取其平
均值計算。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為縱坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)）， 值為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），在對數(shù)坐標(biāo)
紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3，根據(jù)樣品
值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與值計算出標(biāo)準(zhǔn)
曲線的回歸方程式，將樣品的值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為
樣品的實際濃度。
檢測范圍：0.78 U/L - 50 U/L，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線請取用以下濃度值：50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，
6.25 U/L，3.12 U/L，1.56 U/L，0.78 U/L。
檢測限：0.5 U/L
說明
1、由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，
本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險。
2、*終的實驗結(jié)果與試劑的有效性、實驗者的相關(guān)操作以及當(dāng)時的實驗環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必
準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。
3、只有全部使用USCNLIFETM試劑才能保證檢測效果，因為所有試劑都是有關(guān)聯(lián)的，不能混用其他
制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守USCNLIFETM試劑的實驗說明才會得到*佳的檢測結(jié)果。
4、在儲存及溫育過程中避免將試劑暴露在強光中。所有試劑瓶蓋須蓋緊以防止蒸發(fā)和微生物的
污染，因為蛋白水解酶的干擾將導(dǎo)致出現(xiàn)錯誤的結(jié)果。
5、試劑盒保存：請收到試劑盒后盡快將標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液A 和檢測溶液B 保存于-20 ，其余試
劑短期保存請置于4 ，長期保存則置于-20 。開封后的酶標(biāo)板要密封加干燥劑后保存于
-20 ，避免潮濕。
6、濃洗滌液會有鹽析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶。
7、剛開啟的酶聯(lián)板孔中可能會有少許水樣物質(zhì)，此為正常現(xiàn)象，不會對實驗結(jié)果造成任何影響。
8、有效期：6 個月。
9、本操作說明適用于48T 試劑盒，但48T試劑盒所有試劑減半。                                                                                               本試劑盒僅供體外研究使用、不用于臨床診斷!                              咨詢網(wǎng)址；    http://30by.com/

原創(chuàng)作者：上海恒遠生物科技有限公司